Кинематографическим дебютом Хепбёрн стала эпизодическая роль стюардессы в документальном фильме «Голландский язык за семь уроков», затем были ещё небольшие роли в кино и рекламе. В одном из таких фильмов актрису заметила французская писательница Колетт и предложила Одри главную роль в бродвейской постановке своей пьесы «Жижи». В 1953 году Хепбёрн сыграла свою первую главную роль в ленте Вильяма Уайлера «Римские каникулы» и получила за неё премию «Оскар». Самыми лучшими картинами для Хепбёрн стали «Завтрак у Тиффани», «Сабрина», «Моя прекрасная Леди», «Война и мир», «Как украсть миллион».

В 1968 году актриса решила завершить карьеру и в течение восьми лет отказывалась от ролей, которые ей продолжали предлагать. В 1976 году Хепбёрн вновь появляется на экране в картине «Робин и Мэриан», и затем до 1989 года она снимается в нескольких фильмах, которые пользуются у публики умеренным успехом. В 1989 одна сыграла последнюю роль – ангела в фильме Стивена Спилберга «Всегда».

Окончательно оставив кино, Одри Хепбёрн посвятила себя гуманитарной деятельности. В качестве специального посла ЮНИСЕФ Хепбёрн помогала детям беднейших стран мира, занимаясь самыми разными вопросами – от всеобщей вакцинации до доставки продовольствия на территории, где шла гражданская война. Работу сильно облегчало то обстоятельство, что актриса, кроме родных английского, французского и нидерландского, знала испанский и итальянский языки. В рамках своей деятельности на благо детей, Хепбёрн записала аудиодиск со сказками. Уже после её смерти, этот диск получил «Грэмми» как лучший детский альбом разговорного жанра.

Благодаря очень привлекательной внешности, весьма далёкой от общепринятых стандартов середины прошлого века, Одри Хепбёрн была одним из воплощений женской красоты. Кроме того, актриса дружила с модельером Юбером де Живанши – они познакомились на съёмках картины «Сабрина». Хепбёрн на долгие годы стала лицом дома Живанши и музой кутюрье, который не только шил ей красивые наряды, но и создал в её честь свой первый аромат «L’Interdit».

20 января 1993 года Одри Хепбёрн скончалась от рака. Похоронена великая актриса на скромном кладбище швейцарского городка Толошеназ; в этом городке Хепбёрн проживала с 1963 года.

В 1999 году Одри Хепбёрн была признана Американским институтом киноискусства (AFI) в числе великих актрис американского кино (3-е место).