В 1543 году учёный издал свой главный семитомный труд «О строении человеческого тела» (De humani corporis fabrica) с иллюстрациями художника Яна Стефана ван Калькара, где представил обобщённые сведения в области анатомии. В этой работе было исправлено множество ошибок, существовавших согласно традиционным воззрениям. Сторонники Галена жёстко раскритиковали труд, и тогда Везалий оставил преподавательскую деятельность и стал придворным врачом императора Карла V, а затем и Филиппа II. До конца жизни он оставался практикующим врачом, который лечил аристократов. Репутация Везалия как медика была настолько высока, что его вызвали к ложу раненного на турнире короля Франции Генриха II, но он лишь смог констатировать, что ранение смертельно и монарху суждено умереть. Учёный продолжал публиковать труды, но оппоненты встречали их в штыки. Дошло даже до того, что один особо яростный противник Везалия выпустил статью, в которой обосновал, что Гален в своих представлениях отнюдь не заблуждался, просто человеческое тело со времён Галена сильно изменилось.

Обстоятельства гибели учёного не совсем ясны. Известно, что в 1564 году Везалий отправился в Святую Землю. На обратном пути его корабль, вероятно, потерпел крушение возле острова Закинф. Есть также версия, что Везалий заболел тифом или лихорадкой, и матросы оставили его умирать на берегу. Неизвестный человек оплатил похороны учёного, прах которого возложили в одну из местных церквей. Впоследствии церковь была разрушена.